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細(xì)胞爬片制備詳細(xì)過程

發(fā)布時(shí)間：2014/2/7 16:52:07　瀏覽次數(shù)：15955　[字號(hào)：大 中 小]　 [關(guān)閉此頁　打印此頁]

【爬片的準(zhǔn)備】

1.爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用爬片；

 

2.應(yīng)用蓋玻片，可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪時(shí)可用前護(hù)士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開了。

 

如果接種大皿的話，我一般不將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養(yǎng)皿中，到染色時(shí)再將之切開，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時(shí)做幾個(gè)指標(biāo)的染色。

 

3.將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時(shí)，再用三蒸水沖洗3遍（個(gè)人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細(xì)胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。

 

4.高壓后取出放入烤箱中烤干，備用。烤干后可放入超凈臺(tái)中。

 

5.關(guān)于多聚賴氨酸，很多人都將玻片用此處理，以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時(shí)從來沒用過多聚賴氨酸，細(xì)胞貼壁仍然很好，且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測(cè)、免疫熒光等也從未脫過片。

 

 

 

【細(xì)胞爬片】

 

1.胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中。

 

2.加細(xì)胞時(shí)，根據(jù)玻片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。整個(gè)過程注意無菌操作。

 

3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可

 

4.待細(xì)胞貼壁后，可去上清加含藥培養(yǎng)基。

 

5.按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，作用一定時(shí)間后取玻片。取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)的話，將所需數(shù)量的爬片取出時(shí)應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。

 

 

 

 

 

 

【細(xì)胞爬片的固定】

 

細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當(dāng)然，根據(jù)研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色時(shí)就避免洗，因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞在洗的過程中有可能會(huì)脫落。

 

另外在保存細(xì)胞爬片的時(shí)候，我一般用培養(yǎng)皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實(shí)驗(yàn)時(shí)取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個(gè)月的片子做免疫組化是沒有問題的。

 

以下為常用的固定液

 

1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。

將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會(huì)為固體的）細(xì)胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴(yán)，防止其揮發(fā)）固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

 

2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 

主要檢測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等

室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

 

3. 95％乙醇，可用于免疫組化。

優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。

缺點(diǎn)：但醇類對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時(shí)間長(zhǎng)，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度

室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

 

4. 甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 

優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，

缺點(diǎn)： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。

 

實(shí)驗(yàn)方法學(xué)

TC、TG實(shí)驗(yàn)方法