實驗方法學
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?南京建成生物工程研究所
季建平教授主編
東南大學醫學院病生教研室
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一、肝素的配制：
市售肝素凍干粉140單位/mg，1克瓶裝，每瓶140，000單位，稱取0.1克肝素凍干粉，加生理鹽水5ml，配成2800單位/ml。取50～100μl濕潤管壁，可抗凝人血3～5ml，血液不會凝固。老鼠血易凝固，所以最好更濃一些。可以取0.1克肝素凍干粉，加3ml生理鹽水溶解后，取50～100μl,可抗凝鼠血2～4ml。
肝素抗凝管的制備：取0.1克肝素凍干粉，加2.5ml生理鹽水。取100μl～150μl滴入塑料或玻璃管中，濕潤管壁，低于80℃小烤箱中（可以用烤面包的小烤箱），橫向轉動，每隔5～10分鐘轉動一次，直至干燥后放入4℃保存，可使2～5ml血液不凝固。
二、血液樣本的收集：
全血根據收集的條件，分成不抗凝和抗凝兩種。同時，不抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血清；抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血漿。
????1、不抗凝收集血清:將收集好的全血,靜置1～2小時，直接低速離心分離出血清待用或保存。
2、抗凝收集血漿:?收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接低速離心分離血漿(也可靜置半小時左右再低速離心分離血漿)待用或保存。根據不同抗凝劑的性能特征，選擇合適的抗凝劑。實驗室常用的抗凝劑有肝素的各種鹽、EDTA及枸櫞酸鈉。
選擇抗凝的注意點：
①、每一份樣本所加的抗凝劑的量要一致，同時所取的全血的量也要盡量一致;
②、收集抗凝全血后一定要輕輕顛倒，充分抗凝，防止部分血液未接觸到抗凝劑而導致凝固;
???????③、抗凝全血收集的血漿相對較多（1ml抗凝全血能分離出0.4～0.5ml血漿）;
???????④、抗凝收集的血漿冷凍保存后，解凍時可能會出現絮狀渾濁，如有則需要離心去掉渾濁后
用于測定。
????3、全血收集:?收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接定量吸取全血，用冷雙蒸水制備溶血液后用于不同指標的檢測；也可定量吸取全血，轉入EP管，低溫凍存（溫度越低越好），測定之前解凍并按比例加入冷雙蒸水制成溶血液用于檢測。
????4、紅細胞收集：收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，直接離心棄掉血漿，留下層紅細胞，加入3倍體積的生理鹽水，輕輕顛倒混勻，500～1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留沉淀紅細胞,重復2～3次,至上清液無色為止（洗滌紅細胞）。
??????①、直接定量吸取紅細胞，按比例加入冷雙蒸水制成溶血液待測；
②、定量吸取紅細胞，轉入EP管，立即低溫凍存（溫度越低越好），測定之前解凍，并按比例加入冷雙蒸水制成溶血液用于檢測(解凍后部分紅細胞會破裂,因此樣本冷凍保存之前必須進行定量)。
三、動物組織樣本的前處理:
1、取組織塊（0.1g～0.2g）在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，準確稱重，放入勻漿管中。
2、按重量(g):體積(ml)=1:9的比例加入9倍體積的勻漿介質（推薦使用0.86%的生理鹽水）于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊。
3、勻漿的方式有多種：手工勻漿，機器勻漿，超聲粉碎。
①、手工勻漿：將玻璃勻漿管置于冰水浴條件下，手動勻漿，30秒/次，間隔30秒，重復6～8次，制成10%的勻漿液。
②、機器勻漿：用機械式勻漿機（組織搗碎機或內切式勻漿機），8000～10000轉/分，冰水浴條件下，10秒/次，間隙30秒，連續3～5次。（皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間）
③、超聲粉碎：用超聲粉碎機進行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產超聲波發生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次。
鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片，顯微鏡下觀察細胞是否破碎，若沒有則可延長勻漿時間。
4、將制備好的10%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機2500轉/分左右,離心10～15分鐘，取上清液進行測定.（測定相應指標的同時需測一下相應樣本的蛋白濃度，總蛋白測試盒本所有售）
四、植物組織樣本的前處理:
????1、勻漿介質：
一般采用磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L?pH?7.4)或生理鹽水（0.86%或0.9%）,客戶可根據樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環境。
2、組織勻漿液的制備：
①、手工勻漿：取組織塊（0.2g～0.5g）在冰冷的勻漿介質中漂洗，濾紙拭干，準確稱重，放入勻漿管中，按重量(g):體積(ml)=1:4的比例加入4倍體積的勻漿介質于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊，將玻璃勻漿管置于冰水浴條件，手動勻漿，30秒/次，間隔30秒，重復6～8次，制成20%的勻漿液。
②、機器勻漿：取組織塊（0.2g～0.5g）在冰冷的勻漿介質中漂洗，濾紙拭干，準確稱重，放入勻漿管中，按重量(g):體積(ml)=1:4的比例加入4倍體積的勻漿介質于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊，機械式勻漿機（組織搗碎機或內切式勻漿機），10000～15000轉/分，冰水浴條件下，15秒/次，間隙30秒，連續3～5次，制成20%的勻漿液。
③、液氮研磨：取組織塊（0.2g～0.5g）在冰冷的勻漿介質中漂洗，濾紙拭干，準確稱重，放
入研缽中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，加入液氮研磨至粉末狀（研磨要迅速），加入勻漿
介質，充分抽提，制備成20%的勻漿液。
鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片，顯微鏡下觀察細胞是否破碎，若沒有則可延長勻漿時間。
勻漿上清液的制備：將制備好的20%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機3500轉/分左右,離心10～15分鐘，取上清液進行測定（測定相應指標的同時需測一下相應樣本的蛋白濃度，總蛋白測試盒本所有售）。
五、培養細胞的前處理：
1、培養液的測定：
???直接吸取培養液，2500轉/分，離心10分鐘，取上清液進行測定。
[注]：一般建議細胞密度在100萬個/ml以上。
2、培養細胞的測定：
①、細胞沉淀的收集：
對于懸浮培養的細胞，通過離心收集細胞沉淀，將細胞懸液1000轉/分，離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。
對于貼壁培養的細胞，用胰酶將細胞消化下來加入培養基終止消化，或用細胞刮將細胞刮下來；制成細胞懸液，1000轉/分，離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。
[注]：一般建議收集的細胞數量在100萬個以上。
②、細胞沉淀的洗滌：
在細胞沉淀中加入0.5～1ml的等滲緩沖液（推薦?0.1mol/L?pH7～7.4磷酸鹽緩沖液或生理鹽水），輕輕顛倒混勻，?1000轉/分，離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀，重復洗滌2～3次。
③、細胞勻漿液的制備：
在細胞沉淀中加入一定量的等滲緩沖液（等滲緩沖液的加入量根據所測指標的不同而有所改變，一般推薦加入0.5ml，細胞密度不小于100個/ml），混勻，將細胞懸浮于等滲緩沖液中。
[注]：等滲緩沖液推薦使用?0.1mol/L?pH7～7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）或生理鹽水（0.86%或0.9%）
手動勻漿：用移液器將細胞懸浮液轉移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水浴條件，手動勻漿，?1分鐘/次，間隔30秒，重復6～8次，然后取破碎好的勻漿液進行測定（不離心）。
超聲破碎：將細胞懸液置于冰水浴條下，超聲破碎：功率300W，?3～5秒/次，間隔30秒，重
復3～5次；取破碎好的勻漿液進行測定（不離心）。
[注]：細胞破碎好以后取出部分勻漿液顯微鏡觀察，如細胞還未破則增加重復次數；
測定相應指標的同時需測一下相應樣本的蛋白濃度，總蛋白測試盒本所有售。
因為很多裂解液都是蛋白變性劑，因此如果老師測定的指標是酶相關的，一般不建議用裂
解液來裂解細胞。
3、培養液及細胞一起處理后測定：
對于懸浮培養的細胞直接進行破碎
對于貼壁細胞用細胞刮直接將細胞刮下來，制成細胞懸液以后進行破碎
[注]：一般建議收集的細胞密度在100萬個/ml以上。
手動勻漿：用移液器將細胞懸液轉移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水浴條件，手動勻漿，30秒/次，間隔30秒，重復6～8次，然后取破碎好的勻漿液進行測定（不離心）。
超聲破碎：將細胞懸液置于冰水浴條下，超聲破碎：功率300W，?3～5秒/次，間隔30秒，重復3～5次；取破碎好的勻漿液進行測定（不離心）。
[注]：細胞破碎好以后取出部分勻漿液顯微鏡觀察，如細胞還未破則增加重復次數
測定相應指標的同時需測一下相應樣本的蛋白濃度，總蛋白測試盒本所有售。
六、線粒體及微粒體的提取：
1、制備10%的組織勻漿（詳見組織勻漿方式）
2、制備線粒體：取10%的組織勻漿，用普通離心機或低溫低速離心機以1000～2000轉/分,離心10分鐘，棄沉淀，取上清液以8000～10000轉/分（低溫高速離心機）離心15分鐘，沉淀物為線粒體。
3、胞漿部分：分離線粒體后的上清液即為胞漿。
4、制備微粒體：取分離線粒體后的上清液即胞漿，以144000g即40000轉/分,離心30分鐘，沉淀物為微粒體。
5、將分離的線粒體或微粒體分別用冰冷的勻漿介質制備成混懸液，用手工勻漿或機器勻漿使線粒體或微粒體破碎，或者用somiprep150型超聲發生器以振幅14微米超聲處理30秒，或者用國產超聲波發生儀，400安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次，使線粒體或微粒體破碎，待測酶活力，也可用反復凍融的方法使其破碎，但有部分酶活力會受影響。
6、制備好的線粒體、微粒體、胞漿部分可根據您的需要分別進行各種測定。
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七、線粒體的鑒定（中性紅－詹納斯綠B染色）：
在兩張干凈載玻片中央各滴2～3滴中性紅—詹納斯綠B染液，待其中的酒精蒸發完全后，用牙簽挑少許沉淀物均勻涂布在一張玻片的染液中；另取上清液一滴，混于另一張玻片的染液中，兩片分別蓋上蓋玻片，染色5分鐘，在高倍鏡下觀察，被染成亮綠色顆粒即線粒體。
中性紅－詹納斯綠B染色的配制：
A液：取詹納斯綠B（Jana’s?green?B）飽和水溶液（溶解度5.18%）3滴滴入5ml無水乙醇中，混勻。
B液：取飽和中性紅（Neu－tral?red）水溶液（10mg中性紅溶于150ml蒸餾水中，并用黑紙包好貯冰箱）20～30滴滴入5ml無水乙醇中，混勻。
用時將A液和B液混和即成中性紅－詹納氏綠B染液（混和液中的染料不穩定會在24小時內發生沉淀）。
[注]：1、若發現涂片上有成團的染料可將詹納氏綠B?3滴改成1滴或2滴，而將中性紅20～30滴改為10～20滴。
2、本研究所線粒體制備方法較為成熟，一般不需要染色鑒定。
八、紅細胞中SOD的抽提：
1、采集手指血、或肝素抗凝的靜脈血或動脈血50μl[注1]，沖入盛有1～2ml的生理鹽水的帶刻度離心管中,?500～1000轉/分,離心10分鐘。
2、用微量移液器吸去上清液（要吸干凈），留沉淀的紅細胞。
3、加入預冷的雙蒸水0.2ml，混勻（使紅細胞溶解）。
4、加入95%乙醇0.1ml，振蕩30秒。
5、加入三氯甲烷（氯仿）0.1ml置旋渦混勻器充分混勻（抽提）一分鐘。
6、3500轉/分?離心8分鐘。
此時液體分三層：上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷。若上清有混濁可加入少量固體NaCl后再離心5分鐘，即可澄清。
記錄上清液體積，取5～20μl作SOD測定[注2]。
[注1]：大、小鼠可取內眥血，用玻璃毛細管從內眥部斜向咽喉方向刺入，或者剪尾取血，將血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤干時溫度要低于80℃），再用移液器取50μl血，作SOD抽提。血量少時可取10～20μl抗凝全血（做慢性動物試驗，在飼養過程中可以反復取血5～6次）。
[注2]：哺乳動物紅細胞中只有銅鋅SOD，沒有錳SOD。
九、紅細胞膜的制備：
1、?原理和應用?：
?哺乳動物細胞是生物質膜最方便，最經濟的來源，除來源廣泛以外，這種細胞還不含任何細胞器，從而可以得到一種純凈的細胞質膜。紅細胞血影（ghost）膜主要是采用低滲透處理來獲得的，在低滲介質中，紅細胞膨脹，由雙面盤狀變成近乎球形，隨后細胞內容物包括血紅蛋白成分因細胞破裂而釋放出來。最后，通過離心沉淀技術可獲得純凈的紅細胞膜（又稱紅細胞血影膜）。
2、?儀器和設備：常速離心機和低溫高速離心機
3、?試劑(建成生物工程研究所可訂購)
①、等滲緩沖液（本所有售）
②、低滲緩沖液（本所有售）
4、?實驗步驟：
①、收集血液并洗滌紅細胞：
將血液標本直接收集到已肝素化的容器內，立即在4℃離心（1500轉/分，10分鐘），用吸管吸去上清液并小心吸去壓積紅細胞上層的白色絨毛狀膜成分（即白細胞等）。將壓積紅細胞用10倍體積的4℃等滲緩沖液或生理鹽水懸浮，依照上述離心條件離心，如此重復2～3次，直至上清液無色，而且沒有上層白色絨毛層，用吸管吸除上清液，保留壓積紅細胞。
②、制備細胞膜：
取壓積紅細胞，按1：10的比例加入低滲緩沖液，混合均勻，在4℃環境中放置20分鐘，由于溶血，細胞懸液由鮮紅色變成透明暗紅色，（將此懸液對著日光燈看呈透明）。然后在低溫高速離心機上平衡離心（20000g×30分鐘，一般為8000～12000轉/分×30分鐘，4℃。），取出離心管可見底部有一塊粉紅色沉淀，小心吸去或傾斜離心管緩慢倒出暗紅色上清液。沉淀部分再加入10倍體積的低滲緩沖液，混合均勻后重復離心（20000g×30分鐘或8000～12000轉/分離心30分鐘，4℃）兩次或三次，直至沉淀部分呈現乳白色，棄去上清及離心管底部褐色的纖維蛋白樣沉淀斑，收集白色或淺粉紅色血影膜。
③、血影膜的收集和保存：
將血影膜懸浮于一定體積的低滲緩沖液中，混合均勻，取少量樣品用考馬斯亮蘭法或Lowry氏法或其他方法測定蛋白含量。按需要將血影膜用低滲緩沖液稀釋成一定蛋白含量的懸液，定量分裝到小容器中，分次使用從而避免膜樣品反復凍融，在-20℃，-40℃，-70℃或液氮中貯存備用。
④、血影膜的鑒定：
細胞膜的生物化學性質可用乙酰膽減酯酶、Na+K+-ATP酶活性來鑒定；其形態特征可用相
差光學顯微鏡和透射電子顯微鏡來觀察。
5、?注意事項：
①、紅細胞可來源于人和其他哺乳動物（如大鼠、小鼠、豬、羊、牛、兔等），也可直接購買當地中心血庫（或血液供應站）的全紅細胞，后者可免除其他血細胞的干擾。
②、去除血紅蛋白的程度不僅取決于溶血緩沖液的pH值，而且取決于緩沖液的滲透壓。PH值過低，滲透壓過高都會造成血紅蛋白貯留，血影膜沉淀呈現粉紅色。此外溶液中的二價離子濃度達1～5mmol/L時也會使紅蛋與白明顯貯留。細胞低滲溶血緩沖液的體積比應該在1：10左右，比例過大或滲透壓過低則會增加非血紅蛋白蛋白質的損失和膜的破裂，所以，要得到“完整的”無血紅蛋白的膜則需要注意上述幾點。
③、細胞和膜的貯存時間要依研究目的而定。通常，要盡快使細胞與血漿分離，并用等滲緩沖液或生理鹽水洗滌。在50%的比容下，懸液能在4℃保存過夜，但應在24小時內使用。由于白細胞有較高的蛋白酶活性，對細胞的保存影響較大，因此在制備過程中應盡可能去除。細胞膜的制備應在當日內完成，4℃貯存細胞或細胞膜會使得非血紅蛋白的蛋白質損失增加，凍存對細胞膜也是有損傷的，如果可能最好是在膜制備完成后就進行相應的檢測，即使貯存也應該貯存于低滲緩沖液中，并盡快測試。
④、嚴格控制膜的洗滌次數，次數過多會使膜酶活性降低而影響其生化功能。
⑤、一般來說，其他哺乳動物紅細胞（如牛、豬、狗、大鼠等）對低滲溶血的表現是相近的，但也不能簡單地認為所有這些紅細胞在形態學和生物化學性質等方面都是一致。
十、心肌細胞膜的制備：
1、試劑組成:
試劑Ⅰ液：蔗糖0.1M，EDTA2mM，咪唑1mM，pH7.4。
試劑Ⅱ液：尿素1.3M，咪唑12mM，EDTA?2mM，MgCl2·6H2O?0.1mM，(NH4)2SO47.6mM，pH7.4。
試劑Ⅲ液：咪唑25mM，組氨基酸125mM，EDTA?13μM，pH?6.8。
試劑Ⅳ液：咪唑25mM，組氨基酸50mM，EDTA?0.3μM，pH?6.8。
2、操作方法：
①、將實驗動物擊昏處死后，迅速取出心臟，放入冰冷的生理鹽水中洗凈血液，濾紙吸干水分。
②、10%勻漿濾液的制備：取左心室前壁心肌，去掉心內、外膜，稱重（1克左右），加入9倍的Ⅰ液，在冰浴中剪碎，勻漿，二層紗布過濾。
③、將濾液以10000轉/分?離心20分鐘。
④、在沉淀物及心肌細胞膜中加入5ml試劑Ⅰ洗兩次（每次均需以10000轉/分?離心20分鐘）。
⑤、在沉淀物心肌細胞膜中加10ml試劑Ⅱ混勻后于0℃放置48小時。
⑥、將沉淀物混懸液以10000轉/分離心?20分鐘，然后將沉淀物用試劑Ⅲ洗兩次。
⑦、將沉淀物即心肌細胞膜懸于約10ml試劑Ⅳ中，置0℃中保存，于48小時內測ATP酶活性。
十一、血小板的分離：
1、血小板的分離方法一：
①、硅化管的制備：
將硅油與石油醚按3：97的比例配制，取適量于10ml玻璃管內，轉動玻管，使硅油均勻地涂布于玻璃管內壁，把每只玻管內的硅油稍倒干凈后放入烤箱，200℃烤1.5～2小時。
也可直接用干凈的塑料管來代替硅化管，不需進行硅化。
②、血小板的制備：
a、取抗凝全血收集在硅化管內或塑料管內。
b、800轉/分?離心10分鐘。
c、取上層血漿于硅化管或塑料管中，以3000轉/分?離心10分鐘。
d、棄去上層血漿，管底沉淀物即為血小板。
e、用生理鹽水洗三次，每次以3000轉/分?離心10分鐘，去上清留沉淀。
[注]：分離血小板時所有的玻管及滴管均要硅化，或用塑料試管或塑料滴管。
2、血小板分離方法二：
①、將抗凝全血收集在硅化玻璃管或塑料管內，用生理鹽水，或者Han’s液或含EDTA的緩沖液作等體積稀釋，混勻。
②、取淋巴細胞分離液?2ml，置10ml圓底試管中（分離血小板的玻璃試管均要硅化，或用塑料管及塑料滴管）
③、用滴管將稀釋血沿管壁徐徐鋪于分離液界面上，注意勿沖破界面。
④、以2000轉/分?水平離心15分鐘，取出，可見試管內分四層，第一層為含血小板的血漿層；第二層很薄，是白霧狀或白絮狀，為白細胞層；第三層為分離液層；第四層為紅細胞層。
⑤、用尖毛細滴管直接沿管壁吸取第一層富血小板的血漿層，注入硅化玻璃管或塑料管內。
⑥、以3000轉/分，離心10分鐘，將上層血漿倒去，管底沉淀物即為血小板。
⑦、用生理鹽水或含EDTA的溶液清洗2～3次（每次3000轉/分?離心10分鐘），棄上清留沉淀反復2～3次。
⑧、將血小板記數后備用。
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